外泌體是指與細胞間信號傳導和物質(zhì)轉(zhuǎn)運密切相關(guān)的納米級胞外囊泡。細胞間通訊過程中通常涉及一個細胞釋放新囊泡的分裂過程和另一個細胞吞噬的融合過程，而這兩個過程在活細胞器中通常是可逆和可控的。然而，由于外泌體的復雜組成和細胞環(huán)境，關(guān)于融合和分裂過程的膜行為的知識及其調(diào)控因素仍然很少。這一障礙激發(fā)了具有與外泌體相似結(jié)構(gòu)和分裂融合行為的人工囊泡的發(fā)展。
最近，唐本忠院士和深圳大學王東副教授、北京大學閻云研究員在《Angewandte Chemie International Edition》上發(fā)表了題為“Exosome-Mimetic Supramolecular Vesicles with Reversible and Controllable Fusion and Fission”的通訊，提出了具有氧化還原調(diào)節(jié)的可逆融合-分裂功能的人工超分子囊泡。這些囊泡在氧化時趨向于融合在一起形成大尺寸的囊泡，通過還原大囊泡分裂回到小尺寸的囊泡。超分子構(gòu)建塊的聚集誘導發(fā)射（AIE）特性使熒光技術(shù)能夠監(jiān)測囊泡轉(zhuǎn)化過程中的分子構(gòu)型。此外，所提出的囊泡是將siRNA轉(zhuǎn)移到癌細胞的極好的納米載體。
圖1 仿外泌體囊泡的結(jié)構(gòu)及其可逆和可控的融合-分裂行為示意圖。
通過AIE活性分子TPE-BPA、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）和Fe2+離子的自組裝構(gòu)建了Fe2+配位囊泡。TPE-BPA是一種帶負電荷的四臂分子，在聚集態(tài)表現(xiàn)出強烈的熒光發(fā)射。它能夠通過離子相互作用與八個帶正電荷的CTAB分子結(jié)合，自發(fā)地自組裝成中性熒光囊泡。TPE-BPA還帶有配位頭，使TPE-BPA@CTAB超分子囊泡能夠與許多金屬離子配位，如Fe2+和Fe3+。囊泡狀結(jié)構(gòu)可能具有多層結(jié)構(gòu)，其中TPE-BPA作為膜的骨架。Fe2+@囊泡的平均半徑為25nm，而Fe3+@囊泡為54nm。
圖2 （A） Fe2+@囊泡以及Fe3+@囊泡的DLS結(jié)果。插圖是Fe2+@囊泡以及Fe3+@囊泡。比例尺為100 nm。（B）染色Fe2+@囊泡和（C）Fe3+@囊泡的透射電鏡圖像。（D）Fe2+@囊泡暴露于O2和（E）Fe3+@囊泡加入VC時的紫外光譜。（F） Fe2+@囊泡暴露于氧氣和Fe3+@囊泡加入VC的半徑和Zeta電位變化。（G） Fe2+@囊泡在交替添加VC和O2后的可逆尺寸和荷電狀態(tài)變化。
氧化還原處理實現(xiàn)囊泡可逆轉(zhuǎn)化。向Fe2+@囊泡中通入氧氣，462nm處的紫外吸收（這是Fe2+與TPE-BPA配位基團之間的特定配位特征）逐漸降低，Zeta電位從25mv下降到5mv，同時囊泡半徑從25nm增加到54nm。證明了Fe2+@囊泡轉(zhuǎn)化為Fe3+@囊泡。另一方面，加入還原性維生素C，F(xiàn)e3+@囊泡在462nm處紫外吸收逐漸增加，表明Fe2+和TPE-BPA之間出現(xiàn)配位現(xiàn)象。同時，所生成囊泡的Zeta電位、囊泡的大小和形態(tài)都與Fe2+@囊泡相同。
圖3 Fe2+@囊泡暴露于氧氣中（A）實時散射強度變化和（B）尺寸分布。（C）Fe2+@囊泡氧化后融合行為的TEM圖像。Fe3+@囊泡與VC反應后（D）實時散射強度變化和（E）尺寸分布。（F）Fe3+@囊泡還原后分裂過程的TEM圖像。（G）可逆和可控融合和分裂行為的可能機制示意圖。
可逆和可控的融合和分裂行為的可能機制：在Fe2+@囊泡中，由于Fe2+離子配位產(chǎn)生的正電荷的強靜電排斥作用，TPE-BPA分子趨向于相互排斥并堆積成松散狀態(tài)。因此囊泡的膜曲率較大，半徑較小。當Fe2+被O2氧化成Fe3+時，由于Fe3+離子大部分被水解，生成的水合物的配位能力可忽略，正電荷和靜電斥力急劇減弱，形成囊泡膜的致密堆積。因此，囊泡融合在一起，降低了它們的相互作用自由能，形成了曲率較小的大尺寸囊泡。相反，加入VC后，F(xiàn)e3+及其水合物轉(zhuǎn)化為Fe2+離子，對囊泡具有良好的配位能力。靜電斥力的增加會引起囊泡的分裂，進而產(chǎn)生具有大曲率的小尺寸囊泡。
圖4 （A）Fe2+@囊泡加入EDTA的熒光光譜。（B） Fe2+@囊泡加入0.25mM EDTA的低溫透射電鏡圖像。（C）隨著Co2+濃度的增加，囊泡的熒光光譜和（D）Zeta電位半徑的變化。Co2+@囊泡逐步加入EDTA的（E）熒光光譜和（F）Zeta電位半徑變化。
利用AIE分子的熒光發(fā)射，實現(xiàn)囊泡轉(zhuǎn)化過程中分子堆積結(jié)構(gòu)的實時監(jiān)測。由于Fe2+和Fe3+離子都會使熒光猝滅，因此采用Co2+離子進行評價。Co2+離子的逐步添加導致囊泡尺寸減小和Zeta電位增加，對應于電荷引起的分裂過程。同時，熒光發(fā)射逐漸減少和藍移。表明了AIE分子在分裂過程中呈現(xiàn)出越來越扭曲的形態(tài)，并松散地堆積在一起。相反，當EDTA被添加到Co2+@囊泡中去除膜中的電荷，囊泡的增大和Zeta電位的減小，意味著囊泡融合。此外，熒光發(fā)射逐漸增強和紅移，表明AIE分子在融合過程中變得更加密集。
利用仿外泌體囊泡進行藥物輸送。siRNA是最有前途的腫瘤治療藥物之一。當siRNA加入到Fe2+@囊泡溶液中，Zeta電位降低，這表明siRNA與囊泡結(jié)合。siRNA通過siRNA@囊泡的細胞內(nèi)吞作用被HeLa細胞有效地攝取，然后釋放到細胞質(zhì)中。這可能是由于癌細胞的細胞內(nèi)氧化環(huán)境所致，細胞吞噬的Fe2+@囊泡被癌細胞內(nèi)豐富的H2O2氧化為Fe3+@囊泡，從而導致正電荷的減少，削弱了與siRNA的相互作用。
圖5 （A） Hela細胞與siRNA@囊泡孵育4 h后的共定位圖像。用Cy5標記SiRNA(紅色發(fā)射)，溶酶體用LysoTracker染色為綠色發(fā)射，細胞核用Hoechst染色為藍色發(fā)射。放大圖片中的比例尺為2μm。（B）Hela細胞中游離siRNA、囊泡和siRNA@囊泡的細胞存活率。囊泡中TPE-BPA、CTAB和Fe2+的摩爾比為1:8:2，用TPE-BPA濃度計算囊泡的濃度。
亮點小結(jié)
作者成功地制備了一個具有可逆的融合和分裂行為的仿外泌體囊泡。當Fe3+的被氧化成Fe3+，由于Fe3+離子的水解降低了它們的配位能力，使囊泡的正電荷被去除。因此，囊泡趨向于融合在一起，形成大尺寸的囊泡以降低自由能。相反，當Fe3+還原為Fe2+時，電荷恢復，靜電斥力增強，通過分裂過程形成小尺寸的囊泡。此外，利用囊泡構(gòu)建塊的AIE特性，可以監(jiān)測囊泡轉(zhuǎn)化過程中的分子堆積狀態(tài)。這項研究將為外泌體的融合和分裂行為提供創(chuàng)新性的理解。另外，與傳統(tǒng)的“分解”釋藥方式不同，仿外泌體囊泡通過融合過程釋放載藥siRNA，為藥物釋放系統(tǒng)提供了新的候選方案。
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