按照革蘭氏染色法對細菌進行分類，細菌大致可分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌兩大類。其中，大多數(shù)化膿性球菌都屬于革蘭氏陽性菌，而大多數(shù)腸道菌都屬于革蘭氏陰性菌。
從分子結構上區(qū)分，革蘭氏陰性菌具有不對稱的外膜，外膜上有脂多糖（LPS），可作為保護細胞免受化學應激的分子篩，并且內/外膜間有一層很薄的肽聚糖。
而革蘭氏陽性菌只有一層對稱的磷脂膜，且有一層包裹細胞的肽聚糖，比革蘭氏陰性菌厚。
雖然現(xiàn)在熒光顯微技術、熒光原位雜交（FISH）等新技術被用于細菌分類，但是相對操作復雜且需要特定地方操作，不具有隨時檢測能力。
近日，新加坡國立大學的Guillermo C. Bazan和南洋理工大學的Jamie Hinks（共同通訊作者）等人聯(lián)合報道了通過使用鏈延長的共軛低聚電解質COE-S6，可以輕松對細菌進行革蘭氏分類。具體而言，利用COE-S6作熒光膜探針，可以一步就區(qū)分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌。通過共聚焦顯微成像、對含磷脂/脂多糖的模型膜的差示掃描量熱法表明，脂多糖會阻礙COE-S6膜嵌入革蘭氏陰性菌中。通過用非特異性和親脂性膜探針FM 4-64對COE-S6進行復染色，可以對混合物中的兩種革蘭氏類型進行離散標記。因此，利用該單步操作過程可原位觀察復雜的微生物生物膜，從而進行革蘭氏分類。在嵌入COE-S6后，革蘭氏陽性菌的熒光強度顯著增加，用肉眼可以直接觀察。此外，COE-S6不會抑制細菌生長，并且易于使用，是一種有前景的膜特異性熒光探針。
COE-S6特異性的革蘭氏標記
在加入COE-S6前，作者用PBS（磷酸鹽緩沖液）洗滌3次收集的過夜生長的平衡期培養(yǎng)物。作者收集了COE-S6在450-490 nm內發(fā)射形成的熒光圖像。在相同染色條件下（[COE-S6]=2×10-6M），從銅綠假單胞菌檢測到的放射微不足道。原位觀察金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的混合培養(yǎng)物，進一步證明COE-S6可以選擇性染色，其中僅有球菌形金黃色葡萄球菌突出COE-S6的發(fā)射。實驗表明，在相同的實驗條件下，COE-S6在金黃色葡萄球菌中的吸收率為65％，在銅綠假單胞菌中的吸收率為7％，說明COE-S6可用作革蘭氏陽性菌的選擇性原位標記染料。
探究COE-S6特異性膜標記的位置
作者將大腸桿菌O111：B4中的脂多糖（LPS）與大型多層囊泡（LMVs）在緩沖溶液中以8: 100的重量比混合，以生成脂多糖覆蓋的LMVs（LPS-LMVs），模擬革蘭氏陰性菌的外膜。用2×10-6M?COE-S6處理后，觀察到LMVs最外膜層的清晰熒光圖案。此外，共聚焦熒光顯微照片發(fā)現(xiàn)，COE-S6結合在最外層，沒有穿過內囊泡層。在兩種類型中都觀察到了強度相似的顯著熒光信號。將LPS與磷脂（POPE和POPG）的重量比從0：100增加到20：100，進一步驗證LPS對COE-S6選擇性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，LPS的存在會阻礙COE-S6嵌入膜中。
結合使用COE-S6和FM 4-64復染
作者利用熒光顯微鏡成像同時可視化兩種革蘭氏細菌。將等體積的具有相同光密度的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌與PBS混合，并用COE-S6（2×10-6?M）處理15?min，再用FM 4-64（1×10-6?M）處理15 min。檢測發(fā)現(xiàn)，COE-S6存在金黃色葡萄球菌中。FM 4-64染色的兩種細菌，銅綠假單胞菌的發(fā)射強度更高。此外，作者還研究了大腸桿菌K12（革蘭氏陰性菌）。其中，帶有金黃色葡萄球菌的COE-S6和帶有大腸桿菌K12的FM 4-64都出現(xiàn)清晰的膜熒光，但是COE-S6無法滲透到大腸桿菌K12膜中。結果表明，COE-S6作為選擇性膜標記染料在革蘭氏細菌分類中具有潛在應用價值。
原位生物膜革蘭氏分類
作者將每種細菌以相同的接種密度接種到小孔蓋玻片中，并在37?oC下孵育，制備了由糞腸球菌OG1RF和大腸桿菌UTI89組成的生物膜。在檢查前，將所得的生物膜用PBS沖洗，在用4×10-6M?COE-S6和2×10-6M?FM 4-64的混合物染色15 min。其中，圖5顯示了COE-S6（綠色）和FM 4-64（紅色）的發(fā)射位置。糞腸球菌優(yōu)先被COE-S6染色，而大腸桿菌被FM 4-64染色。三維（3D）堆疊視圖揭示了糞腸球菌和大腸桿菌的空間分布。需注意，對比熒光蛋白標記或核酸染色方法，清楚地觀察到內部生物膜結構，糞腸球菌形成短鏈，而大腸桿菌則分散為單個細胞。將COE-S6和FM 4-64結合使用，可監(jiān)控生命系統(tǒng)中的單個細胞類型，而不會損害細胞生存力或膜結構。
COE-S6的光致發(fā)光（PL）光譜測量
最后，作者測量了COE-S6的PL強度，希望以此來確定革蘭氏類型。對比不存在細胞或存在銅綠假單胞菌，存在金黃色葡萄球菌時，COE-S6的PL強度更大。但是添加銅綠假單胞菌后，發(fā)射強度僅略有變化。此外，在365 nm紫外線燈下，作者記錄了未處理的對照、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌三組的熒光強度差異。發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌組的熒光最強，表明COE-S6標記可用于肉眼檢測革蘭氏陽性細菌。
總之，作者提出了一種利用共軛低聚物COE-S6對革蘭氏陽性菌細胞膜染色的方法。利用COE-S6可通過常規(guī)熒光計測量增強的熒光強度或肉眼直接觀察紫外光激發(fā)后的熒光，進行區(qū)分革蘭氏菌的類型。該方法易操作、不需要任何固定或其他預處理要求，即可簡單、快速地區(qū)分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。
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