“工欲善其事，必先利其器”，分析表征技術(shù)和設(shè)備在現(xiàn)代科學(xué)研究中的作用及地位越來越重要。比如在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，很重要的一個(gè)過程是對(duì)生
物大分子(如蛋白質(zhì))結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。最開始科學(xué)家使用X射線晶體學(xué)成像技術(shù)來解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但是鑒于蛋白質(zhì)的松散構(gòu)型，難以規(guī)律集群進(jìn)行成晶。使用這種方法時(shí)，科學(xué)家們需要先對(duì)樣品進(jìn)行結(jié)晶——打包成穩(wěn)定的、有序晶體，然后再允許X射線穿過樣品進(jìn)而成像
。這就造成了結(jié)構(gòu)解析工作復(fù)雜程度大大增加，有時(shí)候解析一種蛋白質(zhì)需要一個(gè)團(tuán)隊(duì)花費(fèi)幾個(gè)月甚至幾年的時(shí)間才能完成。
【何為冷凍電鏡？】
為了提高研究效率和精準(zhǔn)度，科學(xué)家在電子顯微鏡的基礎(chǔ)上于上世紀(jì)70年代開發(fā)出了可以直接“觀察”蛋白質(zhì)
結(jié)構(gòu)的冷凍電鏡(Cryo-EM)。相比于X射線技術(shù)，電子顯微鏡將經(jīng)加速和聚集的電子束轟擊到薄樣上，使用感學(xué)器件來對(duì)散射后的電子成像，而因?yàn)殡娮拥牡虏剂_意波長(zhǎng)非常短，使得這種顯微技術(shù)的分辨率在理論上可以高達(dá)0.1 nm，因而這種可以用來觀測(cè)物質(zhì)精細(xì)結(jié)構(gòu)。
而相對(duì)于傳統(tǒng)電鏡，冷凍電鏡的制樣環(huán)境是液氮浴中的液態(tài)乙烷罐中，這樣樣品會(huì)急速冷卻以至于冰晶都來不及形成，而是形成一種叫做玻璃態(tài)晶的物質(zhì)，因而可以很好地保持生物大分子地結(jié)構(gòu)完整性。
冷凍電鏡樣品結(jié)構(gòu)示意圖
當(dāng)電子束打到分子上之后就會(huì)在膠片上留下不同的印記，盡管這些
印記是二維圖像，但是卻包含了分子的三維信息。在隨后的研究中，科學(xué)家們對(duì)這些圖像進(jìn)行平均化建模，而后產(chǎn)生了蛋白質(zhì)的三維模型。
由于冷凍電鏡的出現(xiàn)大大加快了生命科學(xué)以及臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展，因此對(duì)冷凍電鏡發(fā)明或改進(jìn)具有里程碑意義的德裔生物物理學(xué)家Joachim
Frank、蘇格蘭分子生物學(xué)家和生物物理學(xué)家Richard Henderson和瑞士洛桑大學(xué)生物物理學(xué)榮譽(yù)教授Jacques Dubochet三人共同獲得的了2017年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)(for developing cryo-electron microscopy for the high-resolution structure determination of
biomolecules in solution)。
【原子級(jí)分辨率新冷凍電鏡】
盡管電子顯微鏡的理論分辨率可以達(dá)到1?，但是目前冷凍電鏡的分辨率為1.54~4?，雖然這個(gè)分辨率已經(jīng)
可以借助三維建模軟件來建立蛋白質(zhì)的原子模型(＜4?)，但是還不能實(shí)現(xiàn)對(duì)真實(shí)原子位置直接可視化觀測(cè)(對(duì)分辨率的要求為＜1.5?)。2020年5月22日，在bioRxiv預(yù)印版服務(wù)器上刊登了兩篇關(guān)于冷凍電鏡的最新研究進(jìn)展的論文，研究?jī)?nèi)容均是對(duì)現(xiàn)有的冷凍電鏡進(jìn)行硬件(
電子源、能量過濾和相機(jī))和軟件優(yōu)化，首次利用冷凍電鏡看到蛋白質(zhì)中的單個(gè)原子和化學(xué)鍵變化。這打破了冷凍電鏡的觀測(cè)壁壘，對(duì)于其實(shí)現(xiàn)原子級(jí)分辨率具有里程碑作用。
第一項(xiàng)研究由德國(guó)哥廷根馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所的生物化學(xué)家和電子顯微鏡專家Holger Stark教授領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)完成，該研究以題為“Breaking the next Cryo-EM resolution barrier – Atomic resolution determination of proteins!”的論文
發(fā)表在bioRxiv上。在這項(xiàng)研究工作中，Holger Stark教授團(tuán)隊(duì)使用了一個(gè)帶有附加電子光學(xué)元件(減少電子束的能量傳播和通過像差校正器減少像差來改善了光學(xué)特性)的原型儀器來提高電鏡的分辨性能，并對(duì)脫鐵鐵蛋白的原子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察和建立。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示改進(jìn)
后的冷凍電鏡對(duì)脫鐵鐵蛋白的結(jié)構(gòu)分辨率為1.25?，并且第一次可以看到蛋白質(zhì)中的單個(gè)原子、氫原子的密度和單原子化學(xué)修飾。同時(shí)，利用該冷凍電鏡得到的脫鐵鐵蛋白結(jié)構(gòu)的3D信息含量幾乎是目前世界記錄(1.54?)的兩倍。
真正的原子分辨率:1.25 ?的分辨率顯示單個(gè)原子和氫原子
第二項(xiàng)研究由英國(guó)劍橋分子生物學(xué)醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)實(shí)驗(yàn)室(MRC-LMB)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家A. Radu Aricescu和Sjors H.W. Scheres教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)完成，該研究以“Single-particle cryo-EM
at atomic resolution”的論文發(fā)表在bioRxiv上。在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)使用新的電子源、能量過濾器和相機(jī)對(duì)冷凍電鏡進(jìn)行改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了人類膜蛋白(β3 GABAA受體)1.7?的分辨率, 同時(shí)實(shí)現(xiàn)了老鼠脫鐵鐵蛋白1.2?的分辨率，這一結(jié)果與Holger Stark教授團(tuán)隊(duì)研究
成果基本一致。這項(xiàng)研究提供了一個(gè)蛋白質(zhì)分子的原子分辨率單粒子冷凍電鏡。研究中得到的原子級(jí)精細(xì)圖譜可以詳細(xì)地理解小分子的配位，可視化溶劑分子和多種氨基酸的替代構(gòu)象，以及明確地構(gòu)建有序的酸性側(cè)鏈和聚糖。此外，許多氫原子的散射勢(shì)可以在不同的圖
中顯示出來，從而可以直接分析氫鍵網(wǎng)絡(luò)。
原子分辨率冷凍電鏡
重建的β3 GABAA受體結(jié)構(gòu)
冷凍電鏡進(jìn)軍能源領(lǐng)域
冷凍電鏡最早是為方便生物大分子結(jié)構(gòu)解析而研制出來的，它的主要優(yōu)勢(shì)在于在觀察時(shí)可以保持物質(zhì)在溶液狀態(tài)中的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性。因此，近年來許多科研人員借助冷凍電鏡來研究無生物活性材料的結(jié)構(gòu)
和演變。比如斯坦福大學(xué)崔屹教授聯(lián)合諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)得主朱棣文教授在2017年利用冷凍電鏡對(duì)鋰金屬枝晶進(jìn)行了原子級(jí)別的觀測(cè)，該研究成果發(fā)表在Science[Li et al., Science 358, 506–510 (2017)]上。
2015年，美國(guó)布魯克海文國(guó)家實(shí)驗(yàn)室Oleg Gang教授研究團(tuán)隊(duì)利用冷凍電鏡研究了DNA和Au顆粒自組裝得到的八面體3D中尺度團(tuán)簇。利用重構(gòu)
技術(shù)將這種自組裝結(jié)構(gòu)清楚的展示出來，從而深入的研究了其自組裝機(jī)理，對(duì)于精確控制3D中尺度自組裝材料提供了基礎(chǔ)。
冷凍電鏡研究自組裝
[Nature Nanotechnology, 2015, 10(7):637-644]
冷凍電鏡進(jìn)軍高分子
2020年3月30日，日本信洲大學(xué)Daisuke Suzuki教授課題組采用低溫電子層析成像技術(shù)（cryo-ET），首次得到了納米復(fù)合微凝膠的詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息。cryo-ET表明：在微凝膠內(nèi)部形成的
SDS聚集體充當(dāng)了聚苯乙烯的成核點(diǎn)位，阻止了PS顆粒的融合，解決了長(zhǎng)久以來學(xué)術(shù)界對(duì)該問題的爭(zhēng)論。
【總結(jié)與展望】
原子位置的直接顯示對(duì)于理解蛋白質(zhì)催化的化學(xué)反應(yīng)機(jī)制以及研究藥物結(jié)合和對(duì)蛋白質(zhì)功能的干擾至關(guān)重要。劍橋大學(xué)和馬克斯·普朗克
所研究小組經(jīng)過對(duì)現(xiàn)有冷凍電鏡的改造，首次觀察到了蛋白質(zhì)中的單個(gè)原子，這打破了現(xiàn)有冷凍電鏡的觀測(cè)壁壘，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析工作以及其它物質(zhì)結(jié)構(gòu)的確定提供了更精準(zhǔn)的分析手段。
參考文獻(xiàn)：
(1)https://www.nature.com/articles/d41586-020-01658-1
(2) Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A. & Stark, H. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.05.21.106740 (2020).
(3) Nakane, T. et al. Preprint at
bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.05.22.110189 (2020).
(4) Li Y , Li Y , Pei A , et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy[J]. Science, 2017, 358(6362):506-
510.
(5) Tian Y , Wang T , Liu W , et al. Prescribed nanoparticle cluster architectures and low-dimensional arrays built using octahedral DNA origami frames[J]. Nature Nanotechnology, 2015, 10(7):637-644.
