腸類器官是有用的體外模型，用于旨在理解和治療疾病的基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究。但是，他們的常規(guī)培養(yǎng)依賴于動(dòng)物來源的基質(zhì)，這限制了臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。當(dāng)前的類器官技術(shù)幾乎完全依賴于基底膜提取物，例如Matrigel。這些動(dòng)物來源的基質(zhì)雖然支持細(xì)胞生長，但卻是蛋白質(zhì)和生長因子的不明確混合物，它們?cè)趯?shí)現(xiàn)可再生，可擴(kuò)展和可移植組織方面存在問題。因此，需要基于用于腸類器官生長和擴(kuò)展的材料化學(xué)方法，開發(fā)Matrigel的替代品。實(shí)際上，很少有完全定義的合成水凝膠系統(tǒng)可以擴(kuò)展腸類器官。
【研究成果】
最近，美國科羅拉多大學(xué)波德分校Kristi S. Anseth教授團(tuán)隊(duì)介紹了一種烯丙基硫醚基的可光降解水凝膠，它通過自由基加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（AFCT）反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了快速降解，以支持腸類器官的常規(guī)傳代。全文‘‘The Effect of Thiol Structure on Allyl Sufide Photodegradable Hydrogels and their Application as a Degradable Scaffold for Organoid Passaging’’發(fā)表在材料頂級(jí)期刊《Advanced Materials》上。作者首先用剪切流變學(xué)來表征硫醇和烯丙基硫醚交聯(lián)結(jié)構(gòu)對(duì)降解動(dòng)力學(xué)的影響。
在可溶性硫醇（谷胱甘肽（GSH）15×10-3 M）和光引發(fā)劑（lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate （LAP） 1×10-3 M）存在下，用365 nm光（5 mW cm-2）照射，實(shí)現(xiàn)水凝膠在15 s內(nèi)就完全降解。烯丙基硫醚水凝膠用于支持單腸干細(xì)胞（ISCs）上皮群落的形成，快速光降解可用于干細(xì)胞群落的重復(fù)傳代，而不會(huì)損失形態(tài)或類器官的形成。該平臺(tái)可以支持腸類器官的長期培養(yǎng)，潛在地取代對(duì)動(dòng)物衍生基質(zhì)的需求，同時(shí)還允許系統(tǒng)地改變針對(duì)感興趣的類器官的水凝膠特性。
【圖文解析】
1. 烯丙基硫醚的AFTC反應(yīng)
烯丙基硫醚（AS）水凝膠，通過放大化學(xué)過程顯示出在溫和的光強(qiáng)度和光引發(fā)劑濃度下會(huì)迅速降解。具體而言，使用光引發(fā)劑在溶液中生成游離的硫自由基，這些自由基通過可逆的加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（AFTC）反應(yīng)裂解烯丙基硫醚交聯(lián)鍵。烯丙基硫醚與新的巰基自由基一起再生，可以通過鏈轉(zhuǎn)移到可溶性硫醇中引發(fā)更多的交換循環(huán)（示意圖1）。
2. 多種交聯(lián)劑水凝膠的合成及機(jī)理。
交聯(lián)的水凝膠是通過與四官能聚乙二醇-二芐基環(huán)辛炔（PEG-4DBCO）和烯丙基雙聚乙二醇疊氮化物（PEG3-azide）的應(yīng)變促進(jìn)疊氮化物炔（SPAAC）反應(yīng)形成的（圖1a）。這種生物正交點(diǎn)擊反應(yīng)可在溶液中生理?xiàng)l件下快速進(jìn)行（圖1b）。
內(nèi)由6 wt％ PEG-4DBCO（12×10-3 m DBCO）和乙酰胺（AS-AA），丙酰胺（AS-PA）和苯乙酰胺（AS-PhAA）（14.4×10-3 m疊氮化物）交聯(lián)劑形成的水凝膠在<30 s達(dá)到凝膠點(diǎn)（儲(chǔ)能模量和損耗模量（G’和G”）交叉），并且在600 s之前達(dá)到了的最終儲(chǔ)能模量，在平穩(wěn)期后保持不變（圖1c）。接著頻率掃描顯示，G’和G”與頻率無關(guān)，這表明在沒有自由基產(chǎn)生的情況下具有彈性（圖1d）。
3. 水凝膠降解動(dòng)力學(xué)的研究
在存有可溶性硫醇的情況下，AS-PA，AS-AA和AS-PhAA裂解產(chǎn)物硫醇的pKa值降低（圖2a）。使用配備了光固化附件的流變儀來表征交聯(lián)裂解，以追蹤輻照過程中（365 nm，5 mW cm-2）的G’的變化。如圖2b所示，AS-PA和AS-AA實(shí)現(xiàn)了反向凝膠化，其中AS-PA更快，而AS-PhAA則不會(huì)（即仍然是滲透的3D網(wǎng)絡(luò)）。
具有巰基丙酸甲酯（3MMP）的AS-PA，AS-AA和AS-PhAA凝膠的降解對(duì)應(yīng)于kapp / I0×10-4的速率常數(shù)分別為310±50、190±60和70±10 cm2 mW-1 s-1（圖1c）。為了確定游離硫醇質(zhì)子化狀態(tài)對(duì)烯丙基硫的降解影響，作者將與AS-PA交聯(lián)的水凝膠與各種pKa的可溶性硫醇以及LAP進(jìn)行校準(zhǔn)并降解。
AS-PA水凝膠使用3MMP表現(xiàn)出快速降解，然后分別用GSH，巰基乙酸甲酯（MTG）和硫代乙酸（TAA）降解的速度越來越慢（圖2d）。具有3MMP，GSH，MTG和TAA的AS-PA水凝膠的降解對(duì)應(yīng)于kapp / I0×10-4的速率常數(shù)分別為310±50、240±70、130±60和56±25 cm2 mW-1 s-1（圖1e）。
4. 水凝膠生物體外研究和反復(fù)傳代
由封裝在合成水凝膠中的單個(gè)ISCs形成菌落是機(jī)械敏感的，并取決于水凝膠的儲(chǔ)能模量。因此，用增加濃度的PEG大分子單體配制水凝膠，以提供增加的模量值（圖5a）。觀察4天后，單細(xì)胞已長成Lgr5+干細(xì)胞球形群落，其中群落形成效率（CFE）定義為成長為上皮囊腫的單細(xì)胞部分（圖5b）。
群落極化形成上皮和中央管腔，這是腸類器官的關(guān)鍵形態(tài)特征（圖5c）。由干細(xì)胞（Lgr5）和分化標(biāo)志物（Lct，Lyz1，Muc2和Chga）定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）確定的基因表達(dá)與在干細(xì)胞誘導(dǎo)條件下，烯丙基硫醚化物水凝膠中生長的類器官與在Matrigel中生長的相似（圖5d），這進(jìn)一步表明了干細(xì)胞群落維持在可光降解的烯丙基硫醚水凝膠中。
此外，該系統(tǒng)可逆的實(shí)用性取決于ISC菌落反復(fù)傳代的能力。封裝為p1和p2的單個(gè)細(xì)胞形成群落，其效率略有下降，這可能是由于在每個(gè)傳代步驟之后封裝細(xì)胞密度的降低（圖5e）。
為了提高可逆性的效用，降解反應(yīng)必須在存在細(xì)胞的情況下進(jìn)行，而不會(huì)損害活力。免疫染色證實(shí)了溶菌酶的存在，溶菌酶是分化的Paneth細(xì)胞的標(biāo)志物，Paneth細(xì)胞是腸道隱窩的關(guān)鍵細(xì)胞類型（圖6a）。此外，5-ethynyl-2-deoxyuridine（EdU，24小時(shí)脈沖）染色僅限于隱窩（圖6b）。
分別在22.5％±1.0％和27.5％±0.9％的移植類器官中發(fā)現(xiàn)了溶菌酶和EdU陽性的隱窩（圖6c）。
【陳述總結(jié)】
烯丙基硫醚部分以前曾被用于促進(jìn)交聯(lián)聚合物網(wǎng)絡(luò)中的光誘導(dǎo)可塑性和可逆光圖案的生物分子。然而，由于缺乏對(duì)交換機(jī)理的了解，它們?cè)谡{(diào)節(jié)水凝膠機(jī)械性能方面的應(yīng)用受到了很大的限制。
該文作者報(bào)告了硫醇pKa作為介導(dǎo)烯丙基硫醚交換動(dòng)力學(xué)的決定因素。通過選擇呈現(xiàn)高pKa值的交聯(lián)劑和可溶性硫醇，利用這種理解來提高降解速率。使用LPA（1×10-3 m）和5 mW cm-2的365 nm光，使用AS-PA交聯(lián)劑和GSH（15×10-3 m）可以在15 s的輻照下使水凝膠完全降解。
最終，這種進(jìn)步將減少光線和自由基的照射，并使較厚的樣品降解。然后顯示該支架僅使用RGD粘附肽即可支持單個(gè)囊狀干細(xì)胞中ISC群落的擴(kuò)增?？焖俚墓饨到庾饔迷试S重復(fù)傳代，從而保留了腸道干細(xì)胞形成群落，以及帶有隱窩絨毛區(qū)域的充分發(fā)育類器官的潛力。
該平臺(tái)的使用可以替代常規(guī)類器官培養(yǎng)中使用的Matrigel，也可以用于研究器官發(fā)育中涉及的力學(xué)生物學(xué)過程。
原文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adma.201905366
